使用EXCAVATOR2检测WES的CNV

原创
2019/09/04 19:44
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excavator2是一款利用WES数据进行CNV分析的软件,其他同类软件通常只关注捕获的exon区域,而该软件则进行了延伸,将捕获区域划分为exon和非exon区域两部分,在校正测序深度的分布时对这两部分区域分别分别进行处理,对应的文章发表在Nucleic Acids Research上,链接如下

https://academic.oup.com/nar/article/44/20/e154/2607979

该软件的源代码保存在sourceforge上,链接如下

https://sourceforge.net/projects/excavator2tool/

excavator2在计算测序深度时将reads分为了以下两个部分

  1. in-target reads

  2. off-target reads


in-target表示的是位于exon上的序列,off-target表示的是位于基因间区或者内含子区的序列,同样采用了滑动窗口的方式来统计每个区域的测序深度,只不过稍作变化,全称如下

mean windows read count

简称WMRC, 计算公式如下

单个外显子直接作为一个窗口,而非外显子区域则采用了一个固定长度的窗口,分开统计不同区域的测序深度,并进行校正,校正的时候考虑了GC含量,不同区域的mappability, 外显子的大小等因素。

利用归一化之后的测序深度,计算对照样本和实验样本的log2 ratio值,然后采用HSLM segmentation算法划分segment, 最后通过FastCall算法预测每个segment的拷贝数情况,细分为以下5种

  1. two-copy deletion

  2. one-copy deletion

  3. normal

  4. one-copy duplication

  5. multiple-copy duplicaiton


该软件支持hg19和hg38两个版本,内置了对应的数据库,示意如下

该软件分成了3个模块,对应3个脚本,具体操作步骤如下

1. TargetPerla.pl

提供一个捕获区域的bed文件,计算in-target和off-target区域的GC含量,mappability值,用于后续的归一化操作,用法如下

perl TargetPerla.pl \
SourceTarget.txt \
myTarget.bed \
MyTarget_w50000 \
50000 \
hg19

第一个参数为source target文件,该文件记录了基因组对应的bw文件和fasta文件的路径,内容示意如下

/data/ucsc.hg19.bw /data/hg19.fasta

空格分隔的两列,第一列为bw文件的路径,该文件是软件自带的,位于软件的安装目录,用于计算基因组不同区域的mappability,第二列为fasta文件的路径,用于计算不同区域的GC含量。

第二个参数为捕获区域的bed文件,第三个参数为输出结果的前缀,第四个参数为窗口的固定长度,第五个参数指定基因组的版本。

这一步类似于比对时建立参考基因组的索引,一个芯片建立一次即可,运行成功后,会生成一个文件夹,前缀为MyTarget_w50000。

2. EXCAVATORDataPrepare.pl

计算测序深度,进行归一化处理,用法如下

perl EXCAVATORDataPrepare.pl \
ExperimentalFile.txt \
--processors 6 \
--target MyTarget_w50000 \
--assembly hg19

第一个参数是一个空格分隔的txt文件,指定了样本对应的bam文件,输出结果的路径,样本名称信息,内容示意如下

--processors指定并行的线程数,--target参数指定第一步生成的target的名称,--assembly指定参考基因组的版本。

3. EXCAVATORDataAnalysis.pl

执行HSLM segmentation算法和FastCall算法,进行CNV分析,用法如下

perl EXCAVATORDataAnalysis.pl \
ExperimentalFileAnalysis.txt \
--processors 6 \
--target MyTarget_w50000 \
--assembly hg19 \
--output Results_MyProject_w50K \
--mode pooling

--mode参数表示样本如何进行比较,支持pooling和paired两种模式,第一种模式将所有的实验样本混合与对照样本进行比较,第二种模式则是配对样本模式,比如癌和癌旁,两两之间进行比较,计算log2 ration值。

第一个参数ExperimentalFileAnalysis.txt是一个空格分隔的txt文件,指定了样本的比较操作,对于pooling模式,其内容示意如下

对于paired模式,其内容示意如下

T表示Treat, C表示Control, 后面的数字用于区分不同样本。

--output指定了输出结果的目录,输出结果中提供了CNV区域对应的txt, VCF等文件,同时还提供了可视化的结果,示意如下

·end·

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